مجموعة الترسيب المناعي (الخرز المغناطيسي للبروتين A/G)

IP أو Co-IP هي تقنية تجريبية شائعة لدراسة تفاعلات البروتين أو البروتين مع البروتين (PPIs) باستخدام أجسام مضادة محددة ووسيط يربط الأجسام المضادة (مثل البروتين A/G Agarose أو الخرز المغناطيسي للبروتين A/G)، أو الاستخدام المباشر وسط مقترن بأجسام مضادة محددة (مثل المواد الهلامية agarose أو الخرز المغناطيسي)، ثم عزل مجمعات الأجسام المضادة للمستضد من عينات البروتين المعقدة عن طريق الطرد المركزي أو القوة المغناطيسية، والتي يمكن استخدامها لاحقًا في اللطخة الغربية أو الكتلة قياس الطيف. البروتين G هو بروتين مرتبط بالجلوبيولين المناعي ويعبر عنهالبكتيريا العقديةالنوع C أو G. البروتين A هو بروتين سطح جدار الخلية الموجود فيالمكورات العنقودية الذهبيةبوزن جزيئي 42 كيلو دالتون. البروتين A والبروتين G متشابهان وظيفيًا ويمكنهما الارتباط بشكل خاص بالجلوبيولين المناعي للثدييات (Ig). يمكن استخدام البروتين المؤتلف A وG مع التعديلات المناسبة المرتبطة بالخرز المغناطيسي في الترسيب المناعي أو تنقية الأجسام المضادة. الخرز المغناطيسي للبروتين A مناسب للترسيب المناعي لـ IgG1، IgG2، IgG4، الماوس IgG2a، IgG2b، في حين أن الخرز المغناطيسي للبروتين G مناسب للترسيب المناعي لـ IgG1، IgG2، IgG3، IgG4، الماوس IgG1، IgG2a، IgG2b، IgG3. ، الفئران IgG1، IgG2a، الأجسام المضادة متعددة النسيلة IgG2b وIgG2c. (انظر الجدول الأول للحصول على معلومات محددة)

يعتمد هذا المنتج على الخرز المغناطيسي المسمى بالبروتين A/G الذي تم تطويره وإنتاجه ذاتيًا، مقارنة بالمنتجات المماثلة في السوق، ويربط هذا المنتج الأجسام المضادة بشكل أكثر كفاءة ويحتوي على معدل ربط غير محدد أقل، جنبًا إلى جنب مع المخزن المؤقت الأمثل، فهو يمكن أن تكون مريحة وفعالة لتجارب الهطول المناعي؛ يمكن استخدامه على نطاق واسع في عزل وتنقية البروتينات المستهدفة في عينات مثل ليساتيس الخلية، المواد الطافية للإفراز الخلوي، المصل، الاستسقاء، وما إلى ذلك؛ توفر هذه المجموعة طريقتين للشطف (شطف تغيير الطبيعة وشطف الحمض) لشطف البروتين المستهدف، خاصة أن شطف الحمض لن يحتوي على السلاسل الخفيفة والثقيلة للجسم المضاد، والتي يمكن أن تحل بشكل فعال مشكلة تداخل الأجسام المضادة الثقيلة والخفيفة سلاسل في تجارب الهطول المناعي والبروتين المناعي.

السفينة مع الجليد الرطب؛ يجب تخزين مخزن التحميل المؤقت 5X SDS-PAGE (المخفض) عند درجة -20 وغيرها عند درجة 2-8 لمدة 12 شهرًا.

1. إعداد المجموعة

أ) ارجع إلى الجدول أدناه، وقم بإعداد الكواشف ذات الصلة بنسبة 100-500 ميكرولتر من المحللة لكل عينة؛

ب) إعداد محللة IP التي تحتوي على مثبط الأنزيم البروتيني: ارجع إلى الجدول أعلاه، استخدم {{0}} ميكرولتر من محللة IP التي تحتوي على مثبط الأنزيم البروتيني لكل 0.5-1 مليون خلية للتحلل؛ مزيج المحللة IP مع 50x مثبط الأنزيم البروتيني كوكتيل (يوصى بـ G 2006-250 UL) بنسبة 50: 1، على سبيل المثال، أضف 20 ميكرولتر من مثبط الأنزيم البروتيني الكوكتيل 50x إلى 1 مل من المحللة IP، ثم 1 مل من سيتم الحصول على lysate IP الذي يحتوي على مثبط الأنزيم البروتيني؛ يجب وضع محلول IP المحضر المحتوي على المانع في حمام جليدي أو عند درجة حرارة 4 درجات.

ج) ملاحظة: إذا كان البروتين المستهدف من الترسيب المناعي يتضمن الفسفرة أو تعديل الأسيتيل، فيجب إضافة مثبط الفوسفاتيز أو مثبط دياسيتيلاز (يتم توفيره ذاتيًا)؛ يجب تحضير مثبط يحتوي على محلول IP قبل الاستخدام، ويجب عدم تجميده والاحتفاظ به لاستخدامه لاحقًا.

د) إعداد 1 × TBS: تمييع 10 × TBS العازلة مع الماء النقي للغاية إلى 1 × TBS. على سبيل المثال، أضف 1 مل من المخزن المؤقت 10×TBS إلى 9 مل من الماء فائق النقاء، وهو 1×TBS المخزن المؤقت بعد الخلط جيدًا.

ه) إعداد 1X SDS-PAGE تحميل المخزن المؤقت (مخفض): تم تخفيف كمية مناسبة من 5X SDS-PAGE تحميل المخزن المؤقت (مخفضة) 5 مرات مع الماء النقي للغاية لجعل 1X SDS-PAGE تحميل المخزن المؤقت (خفض)؛ على سبيل المثال، قم بخلط 0.2 مل من المخزن المؤقت للبروتين 5x (مخفض) مع 0.8 مل من الماء فائق النقاء، وهو 1x مخزن مؤقت للتحميل SDS-PAGE (مخفض).

2. تحضير عينة المستضد

يجب إجراء تجارب الهطول المناعي أو الهطول المناعي مباشرة بعد تحلل العينات، وإذا لم يكن الأمر كذلك، فيمكن تخزين العينات في الثلاجة عند درجة -20 أو -80 درجة، لكن التجميد والذوبان قد يؤثران على تفاعلات البروتين البروتين؛ يجب تشغيل جميع خطوات تحلل العينة في حمام جليدي أو عند درجة حرارة 4 درجات لتقليل تحلل البروتين، ويجب أخذ كمية معينة من العينة كمدخل أو إجمالي بعد إعداد العينة للكشف اللاحق بواسطة لطخة غربية.

لعينات الأنسجة:

أ) ينبغي شطف الأنسجة في برنامج تلفزيوني ما قبل البرد لإزالة الدم الزائد تماما. تزن واللحم المفروم إلى قطع صغيرة في الخالط على الجليد.

ب) أضف محللة IP التي تحتوي على مثبط الأنزيم البروتيني بنسبة 100-200 ميكرولتر لكل 10-20 ملجم من الأنسجة، أو قم بتقليل كمية محللة IP إذا كانت هناك حاجة إلى تركيزات أعلى من البروتين.

ج) قم بالتجانس باستخدام جهاز تجانس زجاجي أو جهاز تجانس محمول باليد، أو استخدم مطحنة KZ-III-F ذات درجة الحرارة المنخفضة للطحن الكامل.

د) تم نقل المادة المتجانسة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل، ثم رجها وخلطها، وتم غسلها بالثلج لمدة 30 دقيقة، وكرر النفخ باستخدام ماصة كل 10 دقائق لضمان التحلل الكامل لخلايا الأنسجة.

هـ) جهاز طرد مركزي عند 12,000 xg لمدة 5 دقائق عند 4 درجة، تخلص من الراسب ونضحه من أجل تجارب الترسيب المناعي أو الترسيب المناعي اللاحقة.

لعينات الخلايا الملتصقة:

أ) إذا لزم الأمر، يمكن غسل الخلايا 2-3 مرات باستخدام برنامج تلفزيوني، وامتصاص السائل المتبقي جيدًا في المرة الأخيرة.

ب) اكشط الخلايا بمكشطة الخلية أو هضم التربسين الخلايا لجعلها معلقة بالكامل، واجمعها في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل وجهاز طرد مركزي عند 1,000 xg لمدة 5 دقائق عند 4 درجة، وتخلص من المادة الطافية حتى يتم التخلص منها جمع راسب الخلية.

ج) أضف {{0}} ميكرولتر من محلول IP الذي يحتوي على مثبط الأنزيم البروتيني لكل 0.5-1 مليون خلية (أي ما يعادل بئرًا واحدًا من 6- لوحة بئر)؛ النفخ بشكل مناسب واستخدام حمام جليدي لمدة 3-5 دقيقة لتحلل الخلايا بالكامل، ويجب ألا يكون هناك أي ترسيب خلوي واضح بعد التحلل الكامل؛ إذا كانت كمية الخلايا أكبر، فمن المستحسن أن يتم تقسيم الخلايا إلى 0.5-1 مليون خلية/أنبوب لتحلل بالكامل.

د) جهاز طرد مركزي عند 12,000 xg لمدة 5 دقائق عند 4 درجة، تخلص من الراسب ونضحه من أجل تجارب الترسيب المناعي أو الترسيب المناعي اللاحقة.

لتعليق عينات الخلايا:

أ) جهاز طرد مركزي عند 1000 جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات لتجميع الراسب؛ إذا لزم الأمر، يغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، ثم نضح السائل المتبقي ودوامة بلطف لتفريق الخلايا قدر الإمكان.

ب) أضف {{0}} ميكرولتر من محلول IP الذي يحتوي على مثبط الأنزيم البروتيني لكل 0.5-1 مليون خلية (أي ما يعادل بئرًا واحدًا من 6- لوحة بئر)؛ النفخ بشكل مناسب واستخدام حمام جليدي لمدة 3-5 دقيقة لتفكيك الخلايا بالكامل؛ إذا كانت كمية الخلايا أكبر، فمن المستحسن أن يتم تقسيم الخلايا إلى 0.5-1 مليون خلية/أنبوب لتحلل بالكامل.

ج) جهاز الطرد المركزي عند 12,000 xg لمدة 5 دقائق عند 4 درجة، تخلص من الراسب ونضحه من أجل تجارب الترسيب المناعي أو الترسيب المناعي اللاحقة.

بالنسبة للعينات البكتيرية أو الخميرة:

أ) خذ 1 مل من محلول البكتيريا أو الخميرة وأجهزة الطرد المركزي لإزالة المادة طافية. إذا لزم الأمر، يمكن غسل الخلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، وامتصاص السائل المتبقي جيدا في المرة الأخيرة. دوامة بلطف لتفريق الخلايا قدر الإمكان.

ب) أضف 100-200 ميكرولتر من محلول IP المحتوي على مثبط الأنزيم البروتيني وانفخ برفق لتفريق البكتيريا أو الفطريات بشكل كامل.

ج) حمام جليدي لمدة 10 دقائق، من أجل تحلل أفضل، يمكن هضم البكتيريا والخميرة باستخدام الليزوزيم والإنزيم المحطم للجدار (المقدم ذاتيًا) على التوالي، ثم يتم تحللهما بمحلول IP الذي يحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني.

د) جهاز طرد مركزي عند 12,000 xg لمدة 5 دقائق عند 4 درجة، تخلص من الراسب ونضحه من أجل تجارب الترسيب المناعي أو الترسيب المناعي اللاحقة.

3. إعداد حبة مغناطيسية

أ) أعد تعليق الخرز المغناطيسي SweMagrose Protein A/G بلطف لتكوين تشتت خرز متجانس قدر الإمكان، أضف 20 ul من تشتت الخرز المختلط جيدًا لكل 500 ul من العينة، خذ كمية مناسبة من المغناطيسي حبات في أنبوب EP نظيف وإضافة 1x TBS إلى الحجم النهائي البالغ 0.5 مل (يتم استخدام 20 ميكرولتر من تشتت الخرزة لكل عينة في خطوات الترسيب المناعي التالية كمثال).

ب) إعادة تعليق الخرز المغناطيسي بلطف، ووضعه على حامل الفصل المغناطيسي لمدة 30 ثانية، وإزالة المادة طافية بعناية وكرر الخطوات المذكورة أعلاه مرتين.

ج) تم تعليق الخرز المغناطيسي باستخدام 1x TBS وفقًا لحجم تشتت الخرزة الأولي.

4. ربط الجسم المضاد بالخرز المغناطيسي SweMagrose Protein A/G

أ) تحضير الجسم المضاد: قم بتخفيف الجسم المضاد باستخدام 1x TBS لتحضير محلول عمل الجسم المضاد وفقًا لنسبة التخفيف الموصى بها في تعليمات الجسم المضاد، أو تحضير الجسم المضاد في محلول عمل الجسم المضاد بتركيز نهائي يبلغ 5-50 ميكروغرام/مل والتي يمكن تحضيرها على الجليد؛خياري:استخدم IgG الطبيعي من نفس أنواع الأجسام المضادة لتحضير محلول عمل IgG العادي بنفس نسبة التخفيف أو التركيز النهائي البالغ 5-50 ميكروغرام/مل، أو قم بإزالة الارتباط غير المحدد أو بمثابة عنصر تحكم سلبي. IgG الطبيعي من نفس النوع يعني أنه إذا كان الجسم المضاد المستخدم في الترسيب المناعي اللاحق هو IgG للماوس، فيمكن تخفيف كمية مناسبة من IgG للماوس العادي بـ 1x TBS في هذه الخطوة لتقليل الخلفية أو كعنصر تحكم سلبي.

ب) امتزاز الجسم المضاد: افصل حبات SweMagrose Protein A/G المغناطيسية المحضرة في الخطوة 3 بواسطة المغناطيس، واسحب المادة الطافية، وأضف 500 ميكرولتر من محلول عمل الجسم المضاد أو محلول عمل IgG العادي، وأعد التعليق ثم احتضنها لمدة 15-60 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة على خلاط دوران.

ملاحظة: من الممكن أيضًا احتضان حبات SweMagrose Protein A/G المغناطيسية المعدة في الخطوة 3 مباشرةً بكمية مناسبة من الأجسام المضادة أو IgG الطبيعي.

ج) الفصل المغناطيسي والغسيل: افصل الخرز المحتضن بالمغناطيس، واسحب المادة الطافية، وأضف 500 ميكرولتر من 1 × TBS، وأعد تعليق حبات SweMagrose Protein A/G عن طريق النفخ بلطف باستخدام ماصة، ثم ضعها على رف فصل مغناطيسي لمدة 10 ثوانٍ. قم بإزالة المادة طافية، وكرر الغسيل لمدة ثلاث مرات، وأعد تعليق الخرز باستخدام 1 × TBS بنفس مقدار الحجم الأولي.

ملاحظة: إذا كانت الخرز مكتلة أو قشاري أثناء الحضانة والغسيل، فهي ظاهرة طبيعية ولن تؤثر على النتائج التجريبية.

5. الترسيب المناعي (IP):

أ) إزالة الارتباط غير المحدد (اختياري): يتم تحضين حبات SweMagrose Protein A/G المحضرة في الخطوة 4، والتي تربط IgG الطبيعي، مع العينات عند 4 درجة لمدة 60 دقيقة ويتم فصلها عن طريق الشفط المغناطيسي، ويتم إزالة المواد الطافية تستخدم للتجارب اللاحقة؛ الغرض من هذه الخطوة هو إزالة البروتينات التي ترتبط بشكل غير محدد بالـ IgG الطبيعي.

ب) حضانة العينات مع حبات SweMagrose Protein A/G المترافقة مع الجسم المضاد أو IgG الطبيعي: أضف حبات SweMagrose Protein A/G المترافقة مع الجسم المضاد أو IgG الطبيعي بنسبة 20 ميكروليتر من تعليق الخرزة لكل 500 ميكروليتر من عينة البروتين، ضعها على شاكر جانبي أو خلاط دوار، ويحضن لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية.

ملاحظة 1: إذا كانت الخرزات مكتلة أو قشارية أثناء الحضانة والغسيل، فهي ظاهرة طبيعية ولن تؤثر على النتائج التجريبية.

ملاحظة 2: بدلاً من ذلك، يمكن تحضين الكمية المناسبة من الجسم المضاد أو IgG الطبيعي مع العينة لمدة 1-2 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 درجات، وبعد ذلك يمكن إضافة 10-20 ميكرولتر من تعليق الخرزة المغناطيسية واحتضانها لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

ج) الفصل المغناطيسي: بعد الحضانة، ضع على حامل الفصل المغناطيسي لمدة 10 ثواني لإزالة المادة طافية.

ملحوظة:الاحتفاظ بجزء من المادة طافية لاختبار تأثير هطول الأمطار.

د) غسل: أضف 500 ميكرولتر من 1×TBS، انفخ بلطف الخرز المعلق باستخدام ماصة، ضعه على فاصل مغناطيسي لمدة 10 ثوانٍ لإزالة المادة طافية وكرر الغسيل ثلاث مرات.

ملاحظة: يمكنك أيضًا اختبار OD280 لمحلول الغسيل لتحديد ما إذا كان الغسيل مكتملًا، وإذا كان OD280 أكثر من 0.05، فيجب زيادة عدد مرات الغسيل بشكل مناسب.

6. شطف

اعتماداً على خصائص البروتين المستهدف ومتطلبات التجارب اللاحقة، يمكن اختيار إحدى الطرق التالية للشطف.

a) طريقة الشطف التشويهي:العينات التي تم حذفها بهذه الطريقة مناسبة لـ SDS-PAGE. قم بإزالة أنبوب EP من الفاصل المغناطيسي، وأضف 25 ميكرولتر من 1 × المخزن المؤقت لأخذ عينات البروتين (مخفض) إلى الأنبوب، وقم بتسخينه عند 95 درجة لمدة 5 دقائق، ثم قم بإجراء فصل مغناطيسي لجمع المادة طافية للكشف عن اللطخة الغربية.

b) شطف الحمض:تحتفظ العينة التي تم استخلاصها بهذه الطريقة بنشاطها البيولوجي الأصلي ويمكن استخدامها للتحليل اللاحق للوظيفة. إزالة أنبوب EP من رف الفصل المغناطيسي، وإضافة 20 ميكرولتر من حمض شطف العازلة إلى الأنبوب، وتخلط جيدا واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة، ثم إجراء فصل شفط مغناطيسي، وجمع المادة طافية في أنبوب EP جديد، وعلى الفور أضف 2 ميكرولتر من المخزن المؤقت لشطف النيولايزيشن لضبط درجة الحموضة للمنتج المُزال إلى الحياد، والذي يمكن استخدامه لتحليل ما بعد الوظيفة.

ملاحظة: يمكن للمستخدم ضبط مقدار المخزن المؤقت للشطف المضاف وفقًا للحجم المطلوب.

1. لا تقم بتخزين بروتين SweMagrose A/G في المجموعة عند درجة -20 أو تجميده وذوبانه بشكل متكرر، وإلا فإنه سيؤثر على أداء الخرز المغناطيسي ويسبب أخطاء تجريبية غير ضرورية.

2. يرجى قراءة هذه التعليمات بعناية قبل إجراء عملية الترسيب المناعي.

3. إطار الفصل المغناطيسي للفصل المغناطيسي يحتاج إلى توفير ذاتي

4. إذا كان البروتين المستهدف المترسب مناعيًا يشتمل على الفسفرة أو تعديل الأسيتيل، فيجب توفير مثبطات الفوسفاتيز ومثبطات نزع الأسيتيل المناسبة.

5. الحفاظ على الخرز عند درجة الحموضة 6-8، وتجنب الطرد المركزي عالي السرعة أو التجفيف أو التجميد؛ لا تعرض الخرز للمجالات المغناطيسية لفترات طويلة من الزمن مما قد يسبب تكتل الخرز.

6. يجب خلط الخرزات جيدًا قبل الاستخدام، ويجب أن تكون عملية الخلط لطيفة ولا يجب أن تتعرض لدوامات واهتزازات عنيفة لتجنب تمسخ الجسم المضاد.

7. يوصى باستخدام الضوابط الإيجابية والسلبية (SweMagrose Mouse IgG) في الترسيب المناعي.

8. يجب تنقية عينات البروتين في أسرع وقت ممكن بعد جمعها ووضعها دائمًا عند درجة حرارة 4 درجات أو في حمام جليدي لإبطاء تدهور البروتين أو تمسخه.

9. قد تتجمع الخرزات المغناطيسية عند استخدامها مع الشطف الحمضي، وهي ظاهرة طبيعية ولا تؤثر على الاستخدام الطبيعي للخرزات المغناطيسية.

10. للاستخدام البحثي فقط. لا يستخدم في الإجراءات التشخيصية أو العلاجية.

11. ارتداء الملابس الواقية المناسبة مثل ملابس المختبرات ونظارات السلامة والقفازات.

12. يوضح الجدول 1 قدرة الارتباط للبروتين A والبروتين G بالأجسام المضادة من مصادر عامة وأنواع فرعية مختلفة.

الجدول 1

للاستخدام البحثي فقط. ليس للاستخدام في الإجراءات التشخيصية أو العلاجية!

الوسم : مجموعة الترسيب المناعي (الخرز المغناطيسي للبروتين a/g)، مجموعة الترسيب المناعي في الصين (الخرز المغناطيسي للبروتين a/g) المصنعين والموردين والمصنع