مجموعة الترسيب المناعي (بروتين A/G Agarose)

IP أو Co-IP هي تقنية تجريبية شائعة لدراسة تفاعلات البروتين أو البروتين مع البروتين (PPIs) باستخدام أجسام مضادة محددة ووسيط يربط الأجسام المضادة (مثل بروتين A/G Agarose أو بروتين A/G Magrose)، أو مباشرة باستخدام وسط مقترن بأجسام مضادة محددة (على سبيل المثال الاغاروز أو الخرز المغناطيسي)، ثم عزل مجمعات الجسم المضاد للمستضد من عينات البروتين المعقدة عن طريق الطرد المركزي أو القوة المغناطيسية، والتي يمكن استخدامها لاحقًا في اللطخة الغربية أو قياس الطيف الكتلي. البروتين G هو بروتين مرتبط بالجلوبيولين المناعي يتم التعبير عنه بواسطة البكتيريا العقدية من النوع C أو G. البروتين A هو بروتين سطح جدار الخلية الموجود في المكورات العنقودية الذهبية بوزن جزيئي قدره 42 كيلو دالتون. البروتين A والبروتين G متشابهان وظيفيًا ويمكنهما الارتباط بشكل خاص بالجلوبيولين المناعي للثدييات (Ig). يمكن استخدام البروتين المؤتلف A وG مع التعديلات المناسبة المرتبطة بالاغاروز في الترسيب المناعي أو تنقية الأجسام المضادة. البروتين A agarose مناسب لهطول المناعة البشرية IgG1، IgG2، IgG4، الماوس IgG2a، IgG2b، في حين أن حبات agarose البروتين G مناسبة لهطول المناعة البشري IgG1، IgG2، IgG3، IgG4، الماوس IgG1، IgG2a، IgG2b، IgG3، الفئران IgG1، IgG2a، الأجسام المضادة متعددة النسيلة IgG2b وIgG2c. (انظر الجدول الأول للحصول على معلومات محددة)

يعتمد هذا المنتج بروتين A/G المسمى agarose الذي تم تطويره وإنتاجه ذاتيًا، مقارنة بالمنتجات المماثلة في السوق، ويربط هذا المنتج الأجسام المضادة بشكل أكثر كفاءة وله معدل ربط غير محدد أقل، جنبًا إلى جنب مع المخزن المؤقت الأمثل، يمكن أن يكون مناسبًا وفعالة لتجارب الهطول المناعي؛ يمكن استخدامه على نطاق واسع في عزل وتنقية البروتينات المستهدفة في عينات مثل ليساتيس الخلية، المواد الطافية للإفراز الخلوي، المصل، الاستسقاء، وما إلى ذلك؛ توفر هذه المجموعة طريقتين للشطف (شطف تغيير الطبيعة وشطف الحمض) لشطف البروتين المستهدف، خاصة أن شطف الحمض لن يحتوي على السلاسل الخفيفة والثقيلة للجسم المضاد، والتي يمكن أن تحل بشكل فعال مشكلة تداخل الأجسام المضادة الثقيلة والخفيفة سلاسل في تجارب الهطول المناعي والبروتين المناعي.

السفينة مع الجليد الرطب؛ يجب تخزين مخزن التحميل المؤقت 5X SDS-PAGE (المخفض) عند درجة -20 وغيرها عند درجة 2-8 لمدة 12 شهرًا.

1. إعداد المجموعة

أ) ارجع إلى الجدول أدناه، وقم بإعداد الكواشف ذات الصلة بنسبة 100-500 ميكرولتر من المحللة لكل عينة؛

ب) إعداد محللة IP التي تحتوي على مثبط الأنزيم البروتيني: ارجع إلى الجدول أعلاه، استخدم {{0}} ميكرولتر من محللة IP التي تحتوي على مثبط الأنزيم البروتيني لكل 0.5-1 مليون خلية للتحلل؛ مزيج المحللة IP مع 50x مثبط الأنزيم البروتيني كوكتيل (يوصى بـ G 2006-250 UL) بنسبة 50: 1، على سبيل المثال، أضف 20 ميكرولتر من مثبط الأنزيم البروتيني الكوكتيل 50x إلى 1 مل من المحللة IP، ثم 1 مل من سيتم الحصول على lysate IP الذي يحتوي على مثبط الأنزيم البروتيني؛ يجب وضع محلول IP المحضر المحتوي على المانع في حمام جليدي أو عند درجة حرارة 4 درجات

ج) ملاحظة: إذا كان البروتين المستهدف من الترسيب المناعي يتضمن الفسفرة أو تعديل الأسيتيل، فيجب إضافة مثبط الفوسفاتيز أو مثبط دياسيتيلاز (يتم توفيره ذاتيًا)؛ يجب تحضير مثبط يحتوي على محلول IP قبل الاستخدام، ويجب عدم تجميده والاحتفاظ به لاستخدامه لاحقًا.

د) إعداد 1 × TBS: تمييع 10 × TBS العازلة مع الماء النقي للغاية إلى 1 × TBS. على سبيل المثال، أضف 1 مل من المخزن المؤقت 10×TBS إلى 9 مل من الماء فائق النقاء، وهو 1×TBS المخزن المؤقت بعد الخلط جيدًا.

ه) إعداد 1X SDS-PAGE تحميل المخزن المؤقت (مخفض): تم تخفيف كمية مناسبة من 5X SDS-PAGE تحميل المخزن المؤقت (مخفضة) 5 مرات مع الماء النقي للغاية لجعل 1X SDS-PAGE تحميل المخزن المؤقت (خفض)؛ على سبيل المثال، قم بخلط 0.2 مل من المخزن المؤقت للبروتين 5x (مخفض) مع 0.8 مل من الماء فائق النقاء، وهو 1x مخزن مؤقت للتحميل SDS-PAGE (مخفض).

2. تحضير عينة المستضد

يجب إجراء تجارب الهطول المناعي أو الهطول المناعي مباشرة بعد تحلل العينات، وإذا لم يكن الأمر كذلك، فيمكن تخزين العينات في الثلاجة عند درجة -20 أو -80 درجة، لكن التجميد والذوبان قد يؤثران على تفاعلات البروتين البروتين؛ يجب تشغيل جميع خطوات تحلل العينة في حمام جليدي أو عند درجة حرارة 4 درجات لتقليل تحلل البروتين، ويجب أخذ كمية معينة من العينة كمدخل أو إجمالي بعد إعداد العينة للكشف اللاحق بواسطة لطخة غربية.

لعينات الأنسجة:

أ) ينبغي شطف الأنسجة في برنامج تلفزيوني ما قبل البرد (يوصى G4202) لإزالة الدم الزائد تماما. تزن واللحم المفروم إلى قطع صغيرة في الخالط على الجليد.

ب) أضف محللة IP التي تحتوي على مثبط الأنزيم البروتيني بنسبة 100-200 ميكرولتر لكل 10-20 ملجم من الأنسجة، أو قم بتقليل كمية محللة IP إذا كانت هناك حاجة إلى تركيزات أعلى من البروتين.

ج) قم بالتجانس باستخدام جهاز تجانس زجاجي أو جهاز تجانس محمول باليد، أو استخدم مطحنة KZ-III-F ذات درجة الحرارة المنخفضة للطحن الكامل.

د) تم نقل المادة المتجانسة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل، ثم رجها وخلطها، وتم غسلها بالثلج لمدة 30 دقيقة، وكرر النفخ باستخدام ماصة كل 10 دقائق لضمان التحلل الكامل لخلايا الأنسجة.

هـ) جهاز طرد مركزي عند 12,000 xg لمدة 5 دقائق عند 4 درجة، تخلص من الراسب ونضحه من أجل تجارب الترسيب المناعي أو الترسيب المناعي اللاحقة.

لعينات الخلايا الملتصقة:

أ) إذا لزم الأمر، يمكن غسل الخلايا 2-3 مرات باستخدام برنامج تلفزيوني، وامتصاص السائل المتبقي جيدًا في المرة الأخيرة.

ب) اكشط الخلايا بمكشطة الخلية أو هضم التربسين الخلايا لجعلها معلقة بالكامل، واجمعها في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل وجهاز طرد مركزي عند 1,000 xg لمدة 5 دقائق عند 4 درجة، وتخلص من المادة الطافية حتى يتم التخلص منها جمع راسب الخلية.

ج) أضف {{0}} ميكرولتر من محلول IP الذي يحتوي على مثبط الأنزيم البروتيني لكل 0.5-1 مليون خلية (أي ما يعادل بئرًا واحدًا من 6- لوحة بئر)؛ النفخ بشكل مناسب واستخدام حمام جليدي لمدة 3-5 دقيقة لتحلل الخلايا بالكامل، ويجب ألا يكون هناك أي ترسيب خلوي واضح بعد التحلل الكامل؛ إذا كانت كمية الخلايا أكبر، فمن المستحسن أن يتم تقسيم الخلايا إلى 0.5-1 مليون خلية/أنبوب لتحلل بالكامل.

د) جهاز طرد مركزي عند 12,000 xg لمدة 5 دقائق عند 4 درجة، تخلص من الراسب ونضحه من أجل تجارب الترسيب المناعي أو الترسيب المناعي اللاحقة.

لتعليق عينات الخلايا:

أ) جهاز طرد مركزي عند 1,000 xg لمدة 5 دقائق عند 4 درجة لتجميع الراسب؛ إذا لزم الأمر، يغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، ثم نضح السائل المتبقي ودوامة بلطف لتفريق الخلايا قدر الإمكان.

ب) أضف {{0}} ميكرولتر من محلول IP الذي يحتوي على مثبط الأنزيم البروتيني لكل 0.5-1 مليون خلية (أي ما يعادل بئرًا واحدًا من 6- لوحة بئر)؛ النفخ بشكل مناسب واستخدام حمام جليدي لمدة 3-5 دقيقة لتفكيك الخلايا بالكامل؛ إذا كانت كمية الخلايا أكبر، فمن المستحسن أن يتم تقسيم الخلايا إلى 0.5-1 مليون خلية/أنبوب لتحلل بالكامل.

ج) جهاز الطرد المركزي عند 12,000 xg لمدة 5 دقائق عند 4 درجة، تخلص من الراسب ونضحه من أجل تجارب الترسيب المناعي أو الترسيب المناعي اللاحقة.

بالنسبة للعينات البكتيرية أو الخميرة:

أ) خذ 1 مل من محلول البكتيريا أو الخميرة وأجهزة الطرد المركزي لإزالة المادة طافية. إذا لزم الأمر، يمكن غسل الخلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، وامتصاص السائل المتبقي جيدا في المرة الأخيرة. دوامة بلطف لتفريق الخلايا قدر الإمكان.

ب) أضف 100-200 ميكرولتر من محلول IP المحتوي على مثبط الأنزيم البروتيني وانفخ برفق لتفريق البكتيريا أو الفطريات بشكل كامل.

ج) حمام جليدي لمدة 10 دقائق، من أجل تحلل أفضل، يمكن هضم البكتيريا والخميرة باستخدام الليزوزيم والإنزيم المحطم للجدار (المقدم ذاتيًا) على التوالي، ثم يتم تحللهما بمحلول IP الذي يحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني.

د) جهاز طرد مركزي عند 12,000 xg لمدة 5 دقائق عند 4 درجة، تخلص من الراسب ونضحه من أجل تجارب الترسيب المناعي أو الترسيب المناعي اللاحقة.

3. إعداد الاغاروز

أ) أعد تعليق خرزات SweAgarose Protein A/G بلطف لتكوين تشتت خرز متجانس قدر الإمكان، أضف 20 ul من تشتت الخرز المختلط جيدًا لكل 500 ul من العينة، خذ كمية مناسبة من حبات agarose في أنبوب EP نظيف وأضف 1x TBS إلى الحجم النهائي البالغ 0.5 مل (يتم استخدام 20 ميكرولتر من تشتت الخرزة لكل عينة في خطوات الهطول المناعي التالية كمثال).

ب) أعد تعليق الخرزات بلطف، جهاز الطرد المركزي عند 6,000×g لمدة 30 ثانية عند 4 درجة، قم بإزالة المادة الطافية بعناية وكرر الخطوات المذكورة أعلاه مرتين.

ج) تم تعليق الخرز باستخدام 1x TBS وفقًا لحجم تشتت الخرزة الأولي.

4. ربط الجسم المضاد بخرز SweAgarose Protein A/G

أ) تحضير الجسم المضاد: قم بتخفيف الجسم المضاد باستخدام 1x TBS لتحضير محلول عمل الجسم المضاد وفقًا لنسبة التخفيف الموصى بها في تعليمات الجسم المضاد، أو تحضير الجسم المضاد في محلول عمل الجسم المضاد بتركيز نهائي يبلغ 5-50 ميكروغرام/مل والتي يمكن تحضيرها على الجليد؛ اختياري: استخدم IgG الطبيعي من نفس أنواع الأجسام المضادة لإعداد محلول عمل IgG العادي بنفس نسبة التخفيف أو التركيز النهائي لـ 5-50 ميكروغرام/مل، أو قم بإزالة الارتباط غير المحدد أو بمثابة عنصر تحكم سلبي. IgG الطبيعي من نفس النوع يعني أنه إذا كان الجسم المضاد المستخدم في الترسيب المناعي اللاحق هو IgG للماوس، فيمكن تخفيف كمية مناسبة من IgG للماوس العادي بـ 1x TBS في هذه الخطوة لتقليل الخلفية أو كعنصر تحكم سلبي.

ب) امتزاز الجسم المضاد: افصل خرزات SweAgarose Protein A/G المحضرة في الخطوة 3 بواسطة جهاز طرد مركزي عند 6،000 xg لمدة 30 ثانية عند 4 درجات، ثم اسحب المادة الطافية، وأضف 500 ميكرولتر من محلول عمل الجسم المضاد أو محلول عمل IgG العادي. ، قم بإعادة التعليق ثم احتضانه لمدة 15-60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على خلاط دوران.

ملاحظة: من الممكن أيضًا احتضان حبات SweAgarose Protein A/G المعدة في الخطوة 3 مباشرةً بكمية مناسبة من الأجسام المضادة أو IgG الطبيعي.

ج) فصل الخرز وغسله: افصل الخرز المحتضن بواسطة جهاز الطرد المركزي عند 6,000 xg لمدة 30 ثانية عند 4 درجات، ثم اسحب المادة الطافية، وأضف 500 ميكرولتر من 1×TBS، وأعد تعليق حبات SweAgarose Protein A/G بلطف النفخ باستخدام ماصة، جهاز طرد مركزي عند 6،000 xg لمدة 30 ثانية عند 4 درجات، قم بإزالة طاف، كرر الغسيل لمدة ثلاث مرات، وأعد تعليق الخرز مع 1 × TBS بنفس مقدار الحجم الأولي.

ملاحظة: إذا كانت الخرز مكتلة أو قشاري أثناء الحضانة والغسيل، فهي ظاهرة طبيعية ولن تؤثر على النتائج التجريبية.

5. الهطول المناعي (IP):

أ) إزالة الارتباط غير المحدد (اختياري): يتم تحضين حبات SweAgarose Protein A/G المحضرة في الخطوة 4، والتي تربط IgG الطبيعي، مع العينات عند 4 درجة لمدة 60 دقيقة ويتم فصلها بواسطة جهاز طرد مركزي عند 6، {{5 }} xg لمدة 30 ثانية عند 4 درجة، ويتم استخدام المواد الطافية للتجارب اللاحقة؛ الغرض من هذه الخطوة هو إزالة البروتينات التي ترتبط بشكل غير محدد بالـ IgG الطبيعي.

ب) حضانة العينات مع حبات SweAgarose Protein A/G المترافقة مع الجسم المضاد أو IgG الطبيعي: أضف حبات SweAgarose Protein A/G المترافقة مع الجسم المضاد أو IgG الطبيعي بنسبة 20 ميكروليتر من تعليق الخرزة لكل 500 ميكروليتر من عينة البروتين، ضعها على شاكر جانبي أو خلاط دوار، ويحضن لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية.

ملاحظة 1: إذا كانت الخرزات مكتلة أو قشارية أثناء الحضانة والغسيل، فهي ظاهرة طبيعية ولن تؤثر على النتائج التجريبية.

ملاحظة 2: بدلاً من ذلك، يمكن تحضين الكمية المناسبة من الجسم المضاد أو IgG الطبيعي مع العينة لمدة 1-2 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 درجات، وبعد ذلك يمكن إضافة 10-20 ميكرولتر من معلق حبة الاغاروز واحتضانها لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

ج) جهاز الطرد المركزي: بعد الحضانة، جهاز الطرد المركزي عند 6,000 xg لمدة 30 ثانية عند 4 درجة لإزالة الطاف.

ملاحظة: الاحتفاظ بجزء من المادة طافية لاختبار تأثير هطول الأمطار.

د) الغسل: أضف 500 ميكرولتر من 1×TBS، انفخ بلطف الخرزات المعلقة باستخدام ماصة، جهاز طرد مركزي عند 6,000 xg لمدة 30 ثانية عند 4 درجات لإزالة المادة الطافية وكرر الغسيل ثلاث مرات.

ملاحظة: يمكنك أيضًا فحص OD280 الخاص بمخزن الغسيل المؤقت لتحديد ما إذا كان الغسيل مكتملًا، وإذا كان OD280 أكثر من 0.05، فيجب زيادة عدد مرات الغسيل بشكل مناسب.

6. شطف

اعتماداً على خصائص البروتين المستهدف ومتطلبات التجارب اللاحقة، يمكن اختيار إحدى الطرق التالية للشطف.

a) طريقة الشطف التشويهي:العينات التي تم حذفها بهذه الطريقة مناسبة لـ SDS-PAGE. أضف 25 ميكرولتر من 1 × المخزن المؤقت لأخذ عينات البروتين (مخفض) إلى الأنبوب بعد الطرد المركزي، والحرارة عند 95 درجة لمدة 5 دقائق، ثم الطرد المركزي لجمع المادة طافية للكشف عن لطخة غربية.

b) شطف الحمض:تحتفظ العينة التي تم استخلاصها بهذه الطريقة بنشاطها البيولوجي الأصلي ويمكن استخدامها للتحليل اللاحق للوظيفة. أضف 20 ميكرولتر من محلول شطف الحمض إلى الأنبوب بعد الطرد المركزي، واخلطه جيدًا واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق، ثم جهاز الطرد المركزي لجمع المادة طافية في أنبوب EP جديد، وأضف على الفور 2 ميكرولتر من محلول شطف Neulization لضبط درجة الحموضة المنتج مزال إلى محايد، والتي يمكن استخدامها لتحليل ما بعد وظيفي.

ملاحظة: يمكن للمستخدم ضبط مقدار المخزن المؤقت للشطف المضاف وفقًا للحجم المطلوب.

1. لا تقم بتخزين بروتين SweAgarose A/G في المجموعة عند درجة -20 أو تجميده وذوبانه بشكل متكرر، وإلا فإنه سيؤثر على أداء الخرز المغناطيسي ويسبب أخطاء تجريبية غير ضرورية.

2. يرجى قراءة هذه التعليمات بعناية قبل إجراء عملية الترسيب المناعي.

3. إذا كان البروتين المستهدف المترسب مناعيًا يشتمل على الفسفرة أو تعديل الأسيتيل، فيجب توفير مثبطات الفوسفاتيز ومثبطات نزع الأسيتيل المناسبة.

4. الحفاظ على الخرز عند درجة الحموضة 6-8، وتجنب الطرد المركزي عالي السرعة أو التجفيف أو التجميد، مما قد يسبب تكتل الخرز.

5. يجب خلط الخرزات جيدًا قبل الاستخدام، ويجب أن تكون عملية الخلط لطيفة ولا يجب أن تتعرض لدوامة واهتزاز عنيفين لتجنب تمسخ الجسم المضاد.

6. يوصى باستخدام الضوابط الإيجابية والسلبية (SweAgarose Mouse IgG) في الترسيب المناعي.

7. يجب تنقية عينات البروتين في أسرع وقت ممكن بعد جمعها ووضعها دائمًا عند درجة حرارة 4 درجات أو في حمام جليدي لإبطاء تدهور البروتين أو تمسخه.

8. قد تتجمع حبات الاغاروز عند استخدامها مع شطف الحمض، وهي ظاهرة طبيعية ولا تؤثر على الاستخدام العادي للخرز المغناطيسي.

9. للاستخدام البحثي فقط. لا يستخدم في الإجراءات التشخيصية أو العلاجية.

10. ارتداء الملابس الواقية المناسبة مثل ملابس المختبر ونظارات السلامة والقفازات.

11. يوضح الجدول الأول قدرة الارتباط للبروتين A والبروتين G بالأجسام المضادة من مصادر عامة وأنواع فرعية مختلفة.

الجدول 1

للاستخدام البحثي فقط. ليس للاستخدام في الإجراءات التشخيصية أو العلاجية!

الوسم : مجموعة الترسيب المناعي (بروتين a/g agarose)، مجموعة الترسيب المناعي (بروتين a/g agarose) المصنعين والموردين والمصنع