كالسين صباحا

 

اسم المنتج	قطة.لا.	المواصفات ..
كالسين صباحا	ز1728-0.1ML	0.1 مل

 

 

يعتمد Calcein AM (Calcein acetoxymethyl ester)، على Calcein مع إدخال مجموعة acetoxymethyl ester (AM)، مما يزيد من الكارهة للماء، لذلك يمكنه اختراق غشاء الخلايا الحية بسهولة. كالسين AM بحد ذاته عبارة عن مركب نفاذ للخلية وغير مفلور وكاره للماء، عند دخوله إلى الخلية، يتم تحلله بواسطة استرات داخلية في الخلية لإنتاج جزيء قطبي سالب الشحنة بقوة كالسين الذي لا يمكنه اختراق غشاء الخلية، وبالتالي فهو يتم الاحتفاظ بها داخل الخلية، في حين أن كالسين (الطول الموجي الأقصى للإثارة: 494 نانومتر؛ الحد الأقصى لطول موجة الانبعاث: 517 نانومتر) يمكن أن ينبعث منه اللون الأخضر القوي مضان. بالمقارنة مع مجسات أخرى مماثلة (مثل BCECF AM وCFDA AM)، يعد Calcein AM حاليًا واحدًا من مجسات الفلورسنت الأكثر مثالية لتلطيخ الخلايا الحية بسبب سميته الخلوية المنخفضة جدًا، ولا يوجد أي تأثير تقريبًا على الوظائف الخلوية مثل تكاثر الخلايا أو الانجذاب الكيميائي للخلايا اللمفاوية، وحساسية الرقم الهيدروجيني المنخفضة.

بسبب عدم وجود استريز في الخلايا الميتة، يتم استخدام Calcein AM فقط لاختبار الحيوية ووضع العلامات على المدى القصير للخلايا الحية. لا تخترق صبغة الحمض النووي الفلورسنت الأحمر بروبيديوم يوديد (PI) غشاء الخلية للخلايا الحية، بل تمر عبر المنطقة المضطربة من غشاء الخلية الميتة إلى النواة وتندمج في الحلزون المزدوج للحمض النووي للخلية لإنتاج مضان أحمر ( الإثارة: 535 نانومتر، الانبعاث: 617 نانومتر)، لذلك البقع PI الخلايا الميتة فقط. غالبًا ما يستخدم Calcein AM مع يوديد البروبيديوم (PI) لتلطيخ الخلايا الحية والميتة في وقت واحد. وبما أنه يمكن إثارة كل من Calcein وPI-DNA عند 490 نانومتر، يمكن ملاحظة الخلايا الحية والميتة في وقت واحد عن طريق الفحص المجهري الفلوري. مع الإثارة 545 نانومتر، يمكن ملاحظة الخلايا الميتة فقط.

يمكن استخدام Calcein AM في معظم خلايا الثدييات. لقد ثبت أنه يمكن استخدام Calcein AM في بعض الخلايا النباتية مثل الخلايا الشبيهة بجذر الأرابيدوبسيس وبعض الخمائر مثل Pichia anomala وSaccharomyces cerevisiae. لا تستطيع بعض الطفيليات مثل الليشمانيا دخول الخلايا الحية بسبب مكونات غشاء الخلية، لكن كالسين AM يمكنه دخول الخلايا الطفيلية في المراحل المبكرة من موت الخلايا المبرمج، وبالتالي يستخدم بالتزامن مع PI للكشف عن الطفيليات في المراحل المبكرة من موت الخلايا المبرمج. Calcein AM غير مناسب للاستخدام على الفطريات والبكتيريا لأنها تحتوي على جدران خلوية تمنع Calcein AM من دخول الخلايا.

الكالسين بحد ذاته هو مؤشر لتعقيدات المعادن، ويتم إخماد إشارة الفلورسنت عندما تتجمع مع أيونات معدنية مثل Co²⁺، ني²⁺، النحاس²⁺، الحديد³⁺، ومن²⁺عند درجة الحموضة الفسيولوجية، مما يجعل Calcein AM أيضًا مسبارًا فلوريًا أخضر يمكن استخدامه لتحديد المسام الانتقالية لنفاذية الميتوكوندريا.

هذا المنتج، Calcein AM، عالي النقاء ومذاب في DMSO لا مائي بتركيز 2 مم. التركيز النهائي الشائع الاستخدام لـ Calcein AM هو 0.1-5.0 μM. من أجل الحصول على نتيجة مرغوبة أكثر، يرجى ضبط التركيز النهائي للكالسين بشكل مناسب وفقا لنوع الخلايا والوضع الفعلي للتجربة.

 

 

-20 درجة للتخزين والنقل صالحة لمدة 12 شهرًا.

 

 

عنصر	G1728-0.1ML
كالسين صباحا	0.1 مل
يدوي	1 جهاز كمبيوتر

 

 

تم تحضير محلول العمل لتلطيخ Calcein AM:

تمييع المنتج باستخدام مخزن مؤقت مناسب، مثل مستنبت خالٍ من المصل، HBSS (G4203)، أو PBS (G4202)، لإعداد محلول عمل تلطيخ Calcein AM بتركيز من 0.1-5.0 ميكرومتر.

ملاحظة: يوصى بتعديل التركيز النهائي لـ Calcein AM بشكل مناسب وفقًا لنوع الخلية والواقع التجريبي.

 

إجراءات

1. الفحص المجهري الفلوري أو فحص التصوير الضوئي الفلوري للخلايا المعلقة:

أ) تم حساب الخلايا بعد علاجات معينة حسب التصميم التجريبي. تأخذ الخلايا المناسبة والطرد المركزي لهم في 250 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وتجاهل المادة طافية، وإضافة الحجم المناسب من كالسين AM تلطيخ حل العمل لجعل كثافة الخلية حوالي 1 × 10⁶/ مل.

ب) احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 30-45 دقيقة، يختلف وقت الحضانة الأمثل باختلاف الخلايا. اعتبر 30 دقيقة كوقت الحضانة الأولي، وقم بتحسينه وفقًا للحالة التجريبية المحددة للحصول على نتائج اكتشاف أكثر مثالية.

ج) في نهاية فترة الحضانة، قم بالطرد المركزي عند 250 × جم لمدة 5 دقائق، ثم قم بسحب المادة الطافية، ثم قم بإعادة تعليق الخلايا ببطء عن طريق إضافة وسط استنبات تم تسخينه مسبقًا بمقدار 37 درجة مئوية.

د) كرر الخطوة ج مرتين أو أكثر للغسل بشكل مناسب لإزالة محلول الصبغ المتبقي.

هـ) استبدل وسط الاستزراع الجديد الذي تم تسخينه مسبقًا عند 37 درجة مئوية واحضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أخرى بعيدًا عن الضوء للتأكد من أن الاستراتيز داخل الخلايا يتحلل بشكل كافٍ كالسين AM لإنتاج كالسين مع مضان أخضر.

و) تم طرد الخلايا عند 250 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وتم استنشاق معظم وسط الاستزراع، وتم إعادة تعليق الخلايا مع وسط الاستزراع المتبقي وتلطيخها، ثم ملاحظتها تحت مجهر مضان أو اكتشافها بواسطة مضان zymography.الطول الموجي الأقصى للإثارة للكالسين هو 494 نانومتر، والطول الموجي الأقصى للانبعاث هو 514 نانومتر. إذا لزم الأمر، مضان آخر يمكن إجراء إعادة الصبغ، ويجب تجنب العملية برمتها عن طريق التشغيل الخفيف.

 

2. مقايسة الفحص المجهري الفلوري للخلايا الملتصقة أو مقايسة وضع العلامات على إنزيم مضان:

أ) تم تلقيح الخلايا على أطباق بتري أو ألواح زراعة الخلايا متعددة الآبار أو زواحف الخلايا وتم معالجتها بطرق معينة وفقًا للتصميم التجريبي.

ب) نضح محلول الثقافة وغسل الخلايا 1-2 مرات باستخدام برنامج تلفزيوني.

ج) أضف كمية مناسبة من محلول التلوين Calcein AM ورجه بلطف حتى تغطي الصبغة جميع الخلايا بالتساوي. بشكل عام، حجم 96-حجم صفيحة البئر هو 100 ميكرولتر لكل بئر، 24-حجم صفيحة البئر 250 ميكرولتر لكل بئر، 12-حجم صفيحة البئر 500 ميكرولتر لكل بئر، و 6- لوحة جيدا 1 مل لكل بئر.

د) احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30-45 دقيقة، ويختلف وقت الحضانة الأمثل لخلايا مختلفة. يستغرق 30 دقيقة كوقت الحضانة الأولي، وتحسين وقت الحضانة وفقا للخلايا المستخدمة للحصول على تأثير تلطيخ أكثر مثالية.

هـ) في نهاية فترة الحضانة، تم استبدال وسط الاستزراع بوسط استزراع جديد تم تسخينه مسبقًا عند 37 درجة مئوية وتم تحضينه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أخرى بعيدًا عن الضوء للتأكد من أن الإستريز داخل الخلايا يتحلل بشكل كافٍ كالسين AM لإنتاج كالسين مع مضان أخضر. .

و) نضح سائل الاستزراع، ثم اغسله باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 2-3 مرات، ثم أضف سائل استزراع الخلايا الخالي من المصل ويمكن ملاحظته تحت المجهر الفلوري أو الكشف عنه بواسطة علامة إنزيم الفلورسنت. يمتلك كالسين الحد الأقصى لطول موجة الإثارة وهو 494 نانومتر ويبلغ الحد الأقصى لطول موجة الانبعاث 514 نانومتر، ويمكن تلطيخها بمصابيح الفلورسنت الأخرى إذا رغبت في ذلك، مع الحفاظ على العملية برمتها بعيدًا عن الضوء.

 

3. فحص التدفق الخلوي:

أ) بعد هضم التربسين للخلايا الملتصقة، قم بإعادة تعليق الخلايا في وسط الاستنبات، وعلق الخلايا للاستخدام المباشر، وعد، وقم بالطرد المركزي لكمية مناسبة من الخلايا عند 250 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وتخلص من المادة طافية، وأضف مادة طافية مناسبة. حجم محلول العمل لتلطيخ Calcein AM بحيث تكون الخلايا عبارة عن تعليق أحادي الخلية وتكون كثافة الخلايا حوالي 1 × 10 6 / مل، بحجم 1 مل لكل عينة. ملاحظة: من الضروري إعداد عينة عازلة فقط من الخلايا لاستخدامها كعنصر تحكم سلبي في اختبار قياس التدفق الخلوي. التحكم السلبي لفحص التدفق الخلوي، ومن المستحسن الحفاظ على هذا المخزن المؤقت نفس المخزن المؤقت المستخدم لإعداد حل العمل Calcein AM Staining.

ب) احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية بعيدا عن الضوء.

ج) بعد اكتمال الحضانة، تم جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي عند 250 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إضافة 1 مل من العازلة لكل عينة، resuspend بلطف، وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 250 × ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ملاحظة: هذه الخطوة تزيل الصبغة الزائدة والكواشف التي قد تسبب التبريد الفلوري.

د) إعادة تعليق الخلايا مع 400 ميكرولتر من العازلة. ويمكن أيضا إجراء مزيد من تلطيخ إذا لزم الأمر. لاحظ أن العملية برمتها يجب أن تتم بعيدا عن الضوء. بعد تلطيخها، يتم وضع العينات على الجليد ويمكن الكشف عنها وتحليلها بالتدفق الخلوي خلال ساعة واحدة.

ه) لاحظ أنه تم استخدام عينات الخلايا العازلة فقط وغير الملوثة لإعداد التحكم السلبي لمقياس التدفق الخلوي. يبلغ الحد الأقصى لطول موجة الإثارة لدى كالسين 494 نانومتر والحد الأقصى لطول موجة الانبعاث 514 نانومتر.

 

 

1. جميع أصباغ الفلورسنت لديها مشاكل في التبريد، ويجب توخي الحذر لتجنب الضوء قدر الإمكان لإبطاء التبريد الفلوري.

2. كالسين AM حساس للغاية للرطوبة ويميل إلى التحلل في البيئات الرطبة، لذلك يجب إغلاق محلول كالسين AM بإحكام بالغطاء بعد كل عملية سحب. يوصى بتخزينه في عبوات منفصلة ومغلقة وفقًا للجرعة الواحدة. لا تستخدم نصائح ماصة تحتوي على الماء.

3. بما أن Calcein AM غير مستقر في المحاليل المائية مثل PBS، يجب إعداد محلول العمل المصبوغ واستخدامه الآن.

4. المصل والفينول الأحمر في وسط الثقافة لهما تأثير على تلطيخ Calcein AM، ومن المستحسن أن يتم غسل الخلايا بما فيه الكفاية قبل إضافة محلول العمل Calcein AM.

5. تعتبر الخلايا التي تحمل علامة Calcein AM ذات التألق الموحد خيارًا جيدًا لتتبع الخلايا وتلطيخ السيتوبلازم العام، ومع ذلك، فهي لا ترتبط بأي شيء ويمكن سحبها بشكل نشط من الخلية خلال ساعات قليلة، والاحتفاظ بالكالسين داخل الخلايا الحية. يعتمد على الخصائص الكامنة في نوع الخلية وظروف الثقافة.

6. لا ينبغي أن يتبع تلطيخ Calcein AM تثبيت الألدهيد أو سيتم فقدان Calcein أثناء التثبيت. بالإضافة إلى ذلك، فإن أي اضطراب في غشاء البلازما (على سبيل المثال، عوامل إزالة الترسبات أو معالجة التربسين) سيؤدي إلى تسرب الصبغة من الخلايا.

7. إذا واجه Calcein AM صعوبة في دخول الخلايا، فيمكن استخدام مادة خافضة للتوتر السطحي مثل Pluronic F127. يمكن أيضًا استخدام محلول Calcein AM بتركيز 1/10 بدلاً من وسط الثقافة.

8. يقتصر استخدام هذا المنتج على البحث العلمي من قبل المتخصصين، ولا يجوز استخدامه في إجراءات التشخيص أو العلاج، أو الغذاء أو الدواء، أو تخزينه في مسكن عادي.

9. من أجل سلامتك وصحتك، يرجى ارتداء معطف المختبر والقفازات التي تستخدم لمرة واحدة.

 

للاستخدام البحثي فقط!

 

 

الوسم : كالسين صباحا، الصين كالسين صباحا المصنعين والموردين والمصنع