مقدمة المنتج

اسم المنتج	قطة. لا.	المواصفات.
2 × Fast SYBR Green qPCR Master Mix (لا يوجد ROX)	G3323-01	1 مل
	G3323-05	5×1 مل
	G3323-15	15×1 مل

وصف المنتج/مقدمة

2 × Fast SYBR Green qPCR Master Mix (None ROX) عبارة عن مزيج مسبق خاص 2 × لتفاعل qPCR باستخدام طريقة الفلورة الخيمرية SYBR Green I، والتي تحتوي على جميع مكونات qPCR باستثناء الاشعال وقوالب الحمض النووي، والتي يمكن أن تقلل من خطوات العملية، وتقصير الوقت إضافة العينات وتقليل فرصة التلوث. المكون الأساسي هو بوليميريز الحمض النووي طق الذي تم تصميمه وراثيًا، والذي يمنع بشكل فعال نشاط بوليميريز الحمض النووي ويمنع التضخيم غير المحدد في درجات حرارة منخفضة من خلال الجمع بكفاءة بين الجسم المضاد أحادي النسيلة وبوليميريز الحمض النووي طق، مع العديد من المزايا مثل الخصوصية العالية والحساسية العالية. ويقترن بمخزن مؤقت للتفاعل مُحسّن لـ qPCR. إنها مناسبة جدًا لخصوصية عالية وتفاعل qPCR عالي الحساسية. هذا المنتج عبارة عن كاشف مختلط مسبقًا 2 × يحتوي على التركيز الأمثل لـ SYBR Green I لتفاعل qPCR، والذي يمكنه الحصول على منحنى قياسي جيد في منطقة كمية واسعة، وتقدير دقيق للجينات المستهدفة، وإمكانية تكرار نتائج جيدة، وثقة عالية، وأسرع تفاعل qPCR يمكن أن تكتمل في 30 دقيقة.

شروط التخزين والشحن

السفينة مع الجليد الرطب. يحفظ في درجة -20 بدون ضوء، صالح لمدة 12 شهراً. تجنب دورات التجميد والذوبان. بعد الذوبان، يمكن تخزينه بثبات عند درجة 4 لمدة شهر واحد بدون ضوء.

محتويات المنتج

عنصر	G3323-01	G3323-05	G3323-15
2 × Fast SYBR Green qPCR Master Mix (لا يوجد ROX)	1 مل	5×1 مل	15×1 مل
يدوي	نسخة واحدة

بروتوكول / إجراءات الفحص

قبل البدء

1. في الوقت الحقيقي أداة تضخيم PCR.

2. أنبوب تفاعل خاص أو لوحة تفاعل للتجربة؛

3. الاشعال PCR (مبادئ التصميم التمهيدي المرجعي)؛

4. الماصات الدقيقة وأطراف التعقيم؛

إجراءات

1. يوصي بنظام تفاعل qPCR:

عنصر	20 ميكروليتر آر إكس إن	50 ميكروليتر آر إكس إن	التركيز النهائي
2 × Fast SYBR Green qPCR Master Mix (لا يوجد ROX)	10 μL	25 μL	1×
التمهيدي إلى الأمام (10 ميكرومتر) أ	0.4 μL	1 μL	0.2 μM
عكس التمهيدي (10 ميكرومتر) أ	0.4 μL	1 μL	0.2 μM
القالب ب	عامل	عامل	كما هو مطلوب
مياه خالية من نوكلياز	أضف إلى 20 ميكرولتر	أضف إلى 50 ميكرولتر

أ. عادة، يمكن الحصول على تأثير تضخيم جيد مع التركيز النهائي لـ {{0}}.2 ميكرومتر. عندما يكون أداء التفاعل ضعيفًا، يمكن ضبط تركيز التمهيدي في نطاق 0.2-1.0 ميكرومتر.

ب. تختلف كمية القالب المضافة تبعاً لعدد نسخ الجين المستهدف، وتتم دراسة الكمية المناسبة من إضافة القالب عن طريق تخفيف التدرج. كانت أفضل كمية إضافة لقالب الحمض النووي في نظام التفاعل 20 ميكرولتر أقل من 100 نانوغرام. عندما تم استخدام [كدنا] (حل تفاعل RT) لتفاعل RT-PCR كقالب، يجب ألا تتجاوز كمية الإضافة 10% من حجم qPCR النهائي.

1. إجراء تفاعل PCR (يمكن تعديله وفقًا للأدوات):

منصة	خطوة	عدد الدورات	درجة حرارة	وقت
المرحلة 1	ما قبل التوليد	1	95 درجة	30 ثانية
المرحلة 2	انحطاط	40	95 درجة	3-10 ثانية
المرحلة 2	تمديد الصلب	40	60 درجة	10-30 ثانية
المرحلة 3	منحنى الانصهار	1	الإعدادات الافتراضية للأداة

يوصى باستخدام الإجراء السريع لأداة PCR الكمية الفلورية للعلامة التجارية المقابلة بشكل تفضيلي، وهو متوافق مع إجراء التضخيم القياسي. الإجراء السريع مناسب لمعظم الجينات، ويمكن تجربة الإجراء القياسي لبعض الجينات ذات البنية الثانوية المعقدة.

أ: يمكن لقالب الجينوم إطالة فترة ما قبل الانحطاط بمقدار 2-3 دقيقة؛

ب: مرحلة الدورة: وقت تمسخ الإجراء القياسي هو 10 ثواني. إذا كان الجزء المضخم أقل من 200 نقطة أساس، فإن أقصر خيار للإجراء السريع هو 3 ثواني.

ج: مرحلة الدورة: يتم تحديد وقت التلدين/الاستطالة القياسي لمدة 30 ثانية؛ إذا كان الجزء المضخم أقل من 200 نقطة أساس، يمكن اختيار الإجراء الأقصر بـ 10 ثوانٍ. أكثر من 200 نقطة أساس، الخيار الموصى به هو 30 ثانية؛ لجمع الإشارات الفلورية، يرجى ضبط الإجراء التجريبي وفقًا لدليل التعليمات الخاص بالأداة.

ملحوظة

1. امزجي بلطف رأسًا على عقب قبل الاستخدام. لا دوامة ويهز لتجنب الفقاعات. اخلط الكواشف جيدًا قبل الاستخدام.

2. يجب وضع الكواشف على الجليد عند تحضير محلول التفاعل.

3. يحتوي المنتج على صبغة الفلورسنت SYBR Green، لذا يجب تجنب الضوء القوي عند تحضير محلول تفاعل PCR.

4. يرجى استخدام رأس جديد يمكن التخلص منه لإعداد وتعبئة محلول التفاعل لتجنب التلوث بين العينات.

5. تجنب التجميد والذوبان المتكرر لـ Master Mix وحاول استخدامه خلال شهر واحد بعد الذوبان.

الأدوات المتوافقة

ماركة جهاز PCR	G3323 (لا يوجد روكس)	G3324 (روكس منخفض)	G3325 (روكس عالية)
حياة أبي الحرارية	بيكو ريال تي إم سيكلير	7500/7500 سريع، سلسلة ViiA 7™ QuantStudio™	5700/7000/7300/7700/7900/ 7900HT/7900 HT سريع، StepOne™، StepOne Plus™
ستراتاجين		Mx3000P®/3005P™/4000™
بيو راد	كل سلسلة
إيبندورف	Realplex 2s، Mastercycler®ep realplex
ثالثايومينا	ايكو QPCR
القيفاوي	سمارت سيكلير®
كياجين كوربيت	سلسلة روتور جين®
روش	سلسلة LightCycler™
تاكارا	سلسلة النرد Cycler الحرارية
تحليلات	سلسلة كيو تاور
QTOWER	سلسلة لاين جين

مبادئ التصميم التمهيدي

1. يوصى بأن يكون طول منتج التضخيم بين 80-300 bp؛

2. طول التمهيدي: 18-25 bp;

3. يجب أن يكون محتوى القاعدة G+C في البادئات بين 40%-60%؛

4. فرق قيمة Tm بين البادئات الأمامية والبادئات العكسية أقل من 2 درجة، وقيمة Tm بين 58-62 درجة هي الأفضل؛

5. عشوائية التوزيع الأساسي.

6. من الأفضل ألا تحتوي البادئات على تسلسلات ذاتية التكامل، وإلا فإنها ستشكل بنية دبوس الشعر الثانوية؛

7. يجب ألا يكون هناك أكثر من 4 قواعد تكميلية أو متجانسة بين اثنين من البادئات، وإلا سيتم تشكيل بادئ التمهيدي، وخاصة التداخل التكميلي في نهاية 3'؛

8. يُقترح أن تكون القاعدة الطرفية 3' للبرايمر هي G أو C؛

9. لم يتم العثور على منتجات أخرى غير محددة في نتائج مقارنة NCBI.

استكشاف الأخطاء وإصلاحها

وصف المشكلة	الأسباب المحتملة	الحلول
في نهاية التفاعل، لم يظهر أي منحنى تضخيم أو ظهرت قيمة الأشعة المقطعية بعد فوات الأوان	تركيز القالب منخفض جدًا	كرر التجربة لتقليل مضاعفات تخفيف القالب، وابدأ من أعلى تركيز عندما يكون تركيز العينة غير معروف
	تدهور القالب	تم تحضير القالب مرة أخرى وتكررت التجربة
	هناك مثبطات PCR في النظام	بشكل عام يتم نقل القالب أو زيادة نسبة تخفيف القالب أو إعادة تحضير القالب ذو النقاء العالي وتكراره
	الاشعال قد تتحلل	يجب أولاً اختبار البادئات التي لم يتم استخدامها لفترة طويلة للتأكد من سلامتها بواسطة الرحلان الكهربائي PAGE لاستبعاد احتمال التدهور
	انخفاض كفاءة التضخيم	قم بزيادة تركيز التمهيدي، أو جرب إجراء تضخيم من ثلاث خطوات، أو أعد تصميم التمهيدي
	منتج التضخيم طويل جدًا	تم التحكم في طول منتج التضخيم في نطاق 80-300 نقطة أساس
يظهر التحكم الفارغ الإشارة	رد فعل نظام التلوث	أولاً، ينبغي استبدال مياه التحكم الفارغة. إذا استمر نفس الوضع، فيجب استبدال البادئات والشفاطات وأنابيب PCR أو بدء مزيج رئيسي جديد. يتم إعداد نظام التفاعل في طاولة نظيفة للغاية لتقليل تلوث الهباء الجوي
يظهر التحكم الفارغ الإشارة	يظهر تضخيم غير محدد مثل dimers التمهيدي	بشكل عام، من الطبيعي أن تظهر منتجات التضخيم في التحكم الفارغ بعد 35 دورة، والتي يجب تحليلها باستخدام منحنى الانصهار. إعادة تصميم التمهيدي، وضبط تركيز التمهيدي أو تحسين إجراء تفاعل PCR
منحنى الانصهار له قمم متعددة	التصميم التمهيدي ضعيف	تم إعادة تصميم التمهيدي الجديد وفقًا لمبادئ التصميم التمهيدي
	تركيز التمهيدي مرتفع للغاية	تقليل تركيز التمهيدي بشكل مناسب
	هناك تلوث الجينومي في قالب [كدنا].	يتم هضم محلول الحمض النووي الريبي المستخرج باستخدام إنزيمات الحمض النووي، مثل dsDNase، لإزالة التلوث الجينومي، أو لتصميم بادئات الترانسترون.
ضعف استنساخ التجارب	الخطأ في إضافة العينة كبير	استخدام ماصة دقيقة، مع ماصة دقيقة عالية الجودة لرأس الشفط؛ قالب التخفيف العالي، إضافة قالب كبير الحجم لتقليل خطأ أخذ العينات؛ تم توسيع حجم رد الفعل لـ qPCR
	تركيز القالب منخفض جدًا	كرر التجربة لتقليل أوقات التخفيف للقالب
	انحراف درجة الحرارة في مواقع مختلفة لجهاز qPCR	معايرة أداة qPCR بانتظام
منحنى التضخيم ليس سلسًا	إشارة الفلورسنت ضعيفة جدًا، ويتم إنتاجها بعد تصحيح النظام	تأكد من أن الأصباغ الممزوجة مسبقًا في Master Mix لا تتحلل؛ استبدال إشارة الفلورسنت لجمع المواد الاستهلاكية أفضل qPCR
ينكسر منحنى التضخيم أو ينزلق	كان تركيز القالب أعلى وكانت قيمة نقطة النهاية الأساسية أكبر من قيمة الأشعة المقطعية	تم تخفيض نقطة النهاية الأساسية (قيمة Ct -3) وتمت إعادة تحليل البيانات
انخفضت منحنيات التضخيم للآبار الفردية فجأة بشكل حاد	هناك فقاعات في أنبوب التفاعل	تأكد من أن MIX يذوب تمامًا، ولا يدور ويتأرجح بشكل متساوٍ؛ بعد إضافة العينة، تتم إزالة الفقاعات عن طريق الطرد المركزي باستخدام مادة مرنة خفيفة. تم تمديد وقت ما قبل التسخين إلى 10 دقائق لإزالة الفقاعات