مقدمة المنتج
|
اسم المنتج |
قطة. لا. |
المواصفات. |
|
T4 DNA Ligase (5 وحدة / ميكرولتر ) |
G3340-50 |
250 U |
|
G3340-100 |
500 U |
وصف المنتج/مقدمة
يحفز T4 DNA Ligase تكوين رابطة فوسفوديستر بين 5' فوسفات و 3' هيدروكسيل في DNA المزدوج أو RNA. سوف ينضم هذا الإنزيم إلى النهاية الحادة والنهاية المتماسكة بالإضافة إلى إصلاح الشقوق المفردة في الحمض النووي المزدوج وبعض هجائن DNA / RNA.
تعريف وحدة النشاط: وحدة فايس واحدة من الإنزيم تحفز تحويل 1 نانومول من [32PPi] إلى ATP في 20 دقيقة عند 37 درجة. وتعادل وحدة فايس الواحدة حوالي 200 وحدة ربط طرفية متماسكة (CEU).
T4 DNA Ligase Storage Buffer: 20 ملي مولار تريس-حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.5)، 50 ملي مولار بوكل، 1 ملي مولار DTT، 50% (حجم/حجم) جلسرين.
5 × T4 DNA Ligase Buffer: 250 ملي مولار تريس-حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 7.6)، 50 ملي مولار MgCl2، 5 ملي مولار ATP، 5 ملي مولتر DTT، محسن.
شروط التخزين والشحن
السفينة مع الجليد الرطب؛ يخزن في درجة -20، صالح لمدة 12 شهرًا.
محتويات المنتج
|
رقم المكون |
عنصر |
G3340-50 |
G3340-100 |
|
G3340-1 |
T4 الحمض النووي ليجاسي |
250 U (50 μL) |
500 U (2×50 μL ) |
|
G3340-2 |
5×T4 DNA Ligase Buffer |
1 مل |
2×1 مل |
|
يدوي |
نسخة واحدة |
||
ربط النهاية اللزجة وربط النهاية الحادة
1. أضف ما يلي (يوصى بنظام التفاعل 10-uL) إلى أنبوب طرد مركزي صغير معقم 1.5-مل:
|
عنصر |
مقدار |
|
5×T4 DNA Ligase Buffer |
2 μL |
|
T4 الحمض النووي ليجاسي |
0.5-1 μL |
|
الحمض النووي المتجه الخطي |
X μL |
|
أدخل الحمض النووي |
Y μL |
|
مياه خالية من نوكلياز |
إلى 10 ميكرولتر |
|
المجموع |
10 μL |
2. قم بالخلط بلطف ثم قم بالطرد المركزي لفترة وجيزة لجلب المحتويات إلى قاع الأنبوب.
3. للحصول على أطراف متماسكة، قم بتحضينها عند 25 درجة لمدة 5-30 دقيقة؛ بالنسبة للنهاية الحادة، يتم احتضانها عند 25 درجة أقل من ساعتين أو طوال الليل عند 4 درجات.
4. ضع الأنبوب على الجليد وابدأ فورًا في إجراء تفاعل التحول. أو يمكنك تخزين خليط الربط في درجة حرارة -20 درجة حتى تصبح جاهزًا.
تنفيذ رد فعل التحول
5. أضف خليط الربط المناسب إلى الخلايا المختصة كيميائيًا (مثل E.coli DH5، E.coli Top10، وما إلى ذلك) واخلطه عن طريق النقر بلطف. لا تخلط عن طريق بيبيتينج صعودا وهبوطاً. يمكن تخزين خليط (خليط) الربط المتبقي عند درجة حرارة -20 درجة.
6. احتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد.
7. قم بالاحتضان لمدة 90 ثانية بالضبط في حمام مائي بدرجة حرارة 42 درجة. لا تخلط أو تهز.
8. أخرج أنابيب الطرد المركزي من حمام 42 درجة وضعها على الثلج لمدة 2-5 دقيقة.
9. أضف 900 ميكرولتر من وسط SOC أو LB. ويجب ممارسة تقنية معقمة لتجنب التلوث. هز أنبوب (أنابيب) الطرد المركزي عند 37 درجة لمدة ساعة واحدة عند 225 دورة في الدقيقة في حاضنة اهتزاز.
10. قم بتوزيع الحجم المناسب من كل أنبوب تحويل للطرد المركزي على ألواح أجار LB منفصلة تحمل علامة. يمكن تخزين خليط التحويل المتبقي عند درجة حرارة 4 وطلائه في اليوم التالي، إذا رغبت في ذلك.
11. اقلب الطبق (الأطباق) واحتضنه عند درجة حرارة 37 درجة طوال الليل.
تحليل المحولات
12. تحديد المستعمرات وتحليلها عن طريق عزل البلازميد، PCR، أو التسلسل.
ملحوظة
1. من المستحسن إعداد نظام التفاعل على الجليد.
2. نسبة المولي من 3:1 ~ 10:1 إدراج: يوصى باستخدام المتجهات للربط السريع لإدراج الحمض النووي بالنواقل لإنتاج جزيئات مؤتلفة دائرية.
3. قبل الاستخدام، قم بإذابة 5X DNA Ligase Reaction Buffer في درجة حرارة الغرفة ودوامة بقوة لإذابة أي مادة مترسبة.
4. يجب الحفاظ على T4 DNA Ligase عند درجة -20 حتى خلال 5-10 دقيقة من الاستخدام وإعادته مباشرة إلى درجة -20 بعد الاستخدام.
5. إذا كان الحمض النووي المدرج غير حاد، فيجب نزع فسفرة الناقل بعد تقييد عملية هضم نوكلياز (يوصى بـ G3400) لمنع تعميمه ذاتيًا.
6. من أجل سلامتك وصحتك، يرجى ارتداء نظارات السلامة أو القفازات أو الملابس الواقية.
الوسم : t4 dna ligase (5 u/ul)، الصين t4 dna ligase (5 u/ul) المصنعين والموردين والمصنع
