2 × إن فيوجن كلونينج ميكس بلس

 

اسم المنتج	قطة. لا.	المواصفات.
2 × إن فيوجن كلونينج ميكس بلس	G3351-20T	20 T
	G3351-100T	100 T

 

يوفر 2×In-Fusion Cloning Mix Plus كفاءة استنساخ متزايدة مقارنة بالأجيال السابقة من مجموعات In-Fusion (G3350,2×In-Fusion Cloning Mix)، خاصة للأجزاء المتعددة. إنه مصمم للاستنساخ السريع والموجه لواحد أو 2 ~ 5 أجزاء متعددة من الحمض النووي في أي ناقل. فهو يدمج أجزاء الحمض النووي (على سبيل المثال، المدخلات المولدة بواسطة PCR والمتجهات الخطية) بكفاءة ودقة من خلال التعرف على 15-25 تداخلات bp في نهاياتها. يمكن تصميم هذه التداخلات 15-25 من خلال تصميم الاشعال لتضخيم التسلسلات المطلوبة. يؤدي الإدخال المتزامن لأجزاء متعددة إلى تبسيط الخطوات التجريبية إلى حد كبير وتحسين كفاءة الاستنساخ وتوفير وقتك.

 

1. التصميم التمهيدي ذو الجزء الواحد: 15-25 تم إدخال تسلسلات bp المتوافقة مع طرفي المتجه الخطي في الطرف 5' من التمهيدي التضخيم للإدراج. تصميم الرسم البياني أدناه:

2. التصميم التمهيدي متعدد الأجزاء: مبادئ التصميم التمهيدي عند طرفي المتجه هي نفس مبادئ التصميم التمهيدي ذو الجزء الواحد. منطقة إعادة الضبط بين مبدأ تصميم الجزء التمهيدي هي كما يلي: يوجد تداخل 15-25 نقطة أساس بين التمهيدي العكسي للجزء 1 والتمهيدي الأمامي للجزء 2. يشتمل التمهيدي العكسي للجزء 1 على المنطقة المتداخلة والعكس المحدد المنطقة التمهيدية، يتضمن التمهيدي الأمامي للجزء 2 المنطقة المتداخلة والمنطقة التمهيدية المحددة للأمام، وما إلى ذلك (تظهر المناطق المتداخلة باللون الأحمر). لتحسين الكفاءة، يمكن زيادة المناطق المتداخلة بين الأجزاء ويضمن أن تكون قيم Tm الخاصة بها متسقة. التصميم هو كما يلي:

 

 

السفينة مع الجليد الرطب؛ مخزنة عند درجة -20، صالحة لمدة 12 شهرًا.

 

 

عنصر	G3351-20T	G3351-100T
2 × إن فيوجن كلونينج ميكس بلس	100 μL	5 x 100 μL
pUC19 (خطي، ناقل التحكم، 5 نانوغرام/ميكروليتر)	10 μL	10 μL
التحكم الداخلي (10 نانوغرام/ميكروليتر)	10 μL	10 μL
يدوي	نسخة واحدة

 

 

أداء رد فعل الربط

1. إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1. 5- مل، أضف ما يلي (يوصى بنظام التفاعل 10-uL):

عنصر	مقدار
2 × إن فيوجن كلونينج ميكس بلس	5 μL
ناقلات الحمض النووي	X μL
أدخل الحمض النووي	Y μL
مياه خالية من نوكلياز	أضف إلى 10 ميكرولتر

 

2. قم بالخلط بلطف ثم قم بالطرد المركزي لفترة وجيزة لجلب المحتويات إلى قاع الأنبوب.

3. بالنسبة لتفاعلات إعادة التركيب أحادية الجزء، احتضنها عند درجة حرارة 50 لمدة 15 دقيقة؛ لإعادة التركيب متعدد الأجزاء، احتضان عند 50 درجة لمدة 30 دقيقة.

 

ملحوظة:بالنسبة إلى 3-5 إعادة التركيب متعدد الأجزاء، فإن زيادة وقت التفاعل ستؤدي إلى المزيد من المستعمرات، ولكن يجب ألا تتجاوز ساعة واحدة).

4. ضع الأنبوب على الجليد وتابع فورًا إلى "إجراء تفاعل التحول".

 

 

5. أضف تفاعل الربط المناسب إلى الإشريكية القولونية ذات الكفاءة الكيميائية (مثل DH5، Top10، وما إلى ذلك) واخلطه بلطف. لا تخلط عن طريق بيبيتينج صعودا وهبوطاً.

6. احتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد.

7. صدم الخلايا بالحرارة لمدة 30 ثانية في حمام مائي بدرجة حرارة 42 درجة.

8. ضع الأنابيب على الجليد على الفور واحتضنها لمدة دقيقتين.

9. أضف 900 ميكرولتر من درجة حرارة الغرفة SOC أو LB المتوسطة. قم بتغطية الأنبوب بإحكام ورج الأنبوب أفقيًا عند 225 دورة في الدقيقة لمدة ساعة عند 37 درجة.

10. قم بتوزيع الحجم المطلوب من تفاعل التحول على طبق LB مُسخن مسبقًا يحتوي على المضادات الحيوية المقابلة.

11. قم باحتضان الأطباق طوال الليل عند درجة حرارة 37 درجة.

 

 

اختر مستعمرة فردية من لوحة التحويل، وقم بتحليل المحولات بواسطة مستعمرة PCR أو تقييد هضم الإنزيم.

 

 

1. ينبغي تنقية الحمض النووي المتجه والحمض النووي المُدخل بالهلام وتحليل جودتهما وتركيزهما عن طريق الرحلان الكهربائي. يمكن حذف الماء في تفاعل الربط إذا كان التركيز منخفضًا.

2. The Tm value between the overlapping regions of multiple fragments should be consistent and >60 درجة .

3. من المستحسن أن تكون النسبة المولية للناقل والإدراج هي 1:1~1:3؛ عندما يتم توصيل شظايا 2-3، تكون النسبة المولية بين كل جزء 1:1، ويمكن رفع مستوى نظام تفاعل الربط بنسب متساوية.

4. إذا كان الحجم الإجمالي للناقل والإدراج أكثر من 5 ميكرولتر، فيمكنك توسيع نطاق نظام الربط إلى 20 ميكرولتر.

5. يجب ألا يتجاوز حجم منتج الربط 1/10 من حجم الخلايا المختصة، وإلا ستنخفض كفاءة التحويل بشكل كبير. يمكن زيادة حجم منتج الربط والخلايا المختصة بنسب متساوية (على سبيل المثال، 20 ميكرولتر من نظام الربط يحول 200 ميكرولتر من الخلايا المختصة).

6. يجب الاحتفاظ بمزيج الربط العالمي 2× درجة -20 حتى خلال 5-10 دقيقة من الاستخدام وإعادته فورًا إلى درجة -20 بعد الاستخدام. يوصى بالتجميد في قسامات لتقليل دورات التجميد والذوبان.

7. إذا تم استخدام التثقيب الكهربائي للتحويل، فيجب تنقية الحمض النووي المتجه والحمض النووي المُدخل بطريقة العمود أو طريقة ترسيب الإيثانول.

 

 

1. مخطط العملية التجريبية لبناء البلازميد المؤتلف

 

تم الحصول على أجزاء الحمض النووي المُدخلة عن طريق تضخيم PCR: تم إدخال التسلسل المتماثل 15-25 bp (الأخضر والأزرق الفاتح) من نهاية المتجه الخطي في "نهاية البادئات الأمامية/الخلفية للجزء المستهدف، وتم إدخال كانت التسلسلات النهائية 5 'و 3' للمنتج المضخم متوافقة تمامًا مع التسلسلين النهائيين للمتجه الخطي، على التوالي.

B. خطية ناقلات البلازميد: تم استخدام تقييد نوكلياز داخلي أو PCR عكسي للحصول على ناقلات خطية.

C. In-Fusion Cloning Plus: تم خلط المادة الحاملة الخطية وجزء الإدخال المنقى والمستعاد بشكل متناسب، واكتمل التفاعل عند 50 درجة لمدة 15 دقيقة.

د. الخلايا المحولة: يتم تحويل منتجات التفاعل مباشرة إلى خلايا الإشريكية القولونية المختصة، ونمو مستعمرة وحيدة النسيلة، واستخراجها من القرص لإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل، وهضم الإنزيم، وتسلسل النسخ التجريبية للفحص الإيجابي.

 

2. طفرات نقطة واحدة البلازميد المؤتلف بناء مخطط العملية التجريبية

أ. تفاعل البوليميراز المتسلسل ثنائي الأجزاء (يعمل تفاعل البوليميراز المتسلسل على تضخيم شظايا الحمض النووي عند طرفي موقع الطفرة): تم تصميم البادئات التكميلية في موقع الطفرة (البرتقالي)، وتم تصميم البادئات عند طرفي الجين الطافر لتقديم تسلسلات متماثلة في النهاية للمتجه الخطي 15-25 bp (الأخضر والأزرق الفاتح). باستخدام بادئات مختلفة لتضخيم PCR، على التوالي، يتم إجراء طفرات في قطعتين مع تسلسلات متماثلة لاثنين من طفرات الجينات (المتضمنة)، على التوالي.

B. خطية ناقلات البلازميد: تم استخدام تقييد نوكلياز داخلي أو PCR عكسي للحصول على ناقلات خطية.

C. In-Fusion Cloning Plus: تم خلط المادة الحاملة الخطية وجزء الإدخال المنقى والمستعاد بشكل متناسب، واكتمل التفاعل عند 50 درجة لمدة 15 دقيقة.

د. الخلايا المحولة: يتم تحويل منتجات التفاعل مباشرة إلى خلايا الإشريكية القولونية المختصة، ونمو مستعمرة وحيدة النسيلة، واستخراجها من القرص لإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل، وهضم الإنزيم، وتسلسل النسخ التجريبية للفحص الإيجابي.

 

3. رسم تخطيطي للعملية التجريبية لبناء البلازميد المؤتلف متعدد الأجزاء

أ. تضخيم PCR لأجزاء إضافية: تمت إضافة التسلسلات المتماثلة (المميزة باللون الأخضر والأزرق الداكن والأصفر والأزرق الفاتح) إلى النهاية 5' من بادئات التضخيم، بحيث كان هناك تسلسل متماثل 15-25 bp بين منتجات التضخيم وبين منتجات التضخيم والمتجه الخطي. تم استخدام أزواج تمهيدية مختلفة لتضخيم شظايا الحمض النووي (البرتقالي والأحمر والأرجواني).

B. خطية ناقلات البلازميد: تم استخدام تقييد نوكلياز داخلي أو PCR عكسي للحصول على ناقلات خطية.

C. In-Fusion Cloning Plus: تم خلط المادة الحاملة الخطية وجزء الإدخال المنقى والمستعاد بشكل متناسب، واكتمل التفاعل عند 50 درجة لمدة 15 دقيقة.

د. الخلايا المحولة: يتم تحويل منتجات التفاعل مباشرة إلى خلايا الإشريكية القولونية المختصة، ونمو مستعمرة وحيدة النسيلة، واستخراجها من القرص لإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل، وهضم الإنزيم، وتسلسل النسخ التجريبية للفحص الإيجابي.

 

للاستخدام البحثي فقط!

 

 

الوسم : 2 × مزيج الاستنساخ فيوجن بلس، الصين 2 × مزيج استنساخ فيوجن بلس المصنعين والموردين والمصنع